大家好,今天小编来为大家解答以下的问题，关于免疫组化一抗孵育时间，一抗4℃孵育最多几小时这个很多人还不知道，现在让我们一起来看看吧！
本文目录
一、抗原修复的选择合适的孵育时间
之一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究 *** 质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育，根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜，原因是：
1.长时间的孵育可以使一些非特异 *** 的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前销售的抗体，纯度较高，特异 *** 较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好。
3.长时间的孵育，较容易引起切片的脱落，造成染色的失败。
4.长时间的孵育，不利于临床病理报告的发出。
X、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴 *** 的现象。
免疫组化染色 *** 较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，之一抗体有单克和多 *** 炎分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：之一抗体选用的是单 *** 鼠抗人**抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG，这样才能连接上（目前生产厂家已生产出混合型抗体，即既适合于单 *** 抗体，也适合于多 *** 抗体。使用者不用担心连接不上，随便使用都可，但如果没有订购混合型的试剂盒，就必须注意的型号，使之完全适合所选用的抗体。）孵育的时间可在10分钟，20分钟或者30分钟，一般在室温中进行，如果室温低于20℃以下，则可在37℃的孵育箱中进行。
XI、复合物的使用及孵育时间的确定。
各种 *** 有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。
免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。
1.单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次 *** ，保证切片没有相互交叉污染的机会。
冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而 *** 下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。
3.冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。
4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。
刘彦仿指出：中 *** 及弱碱 *** 条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸 *** 条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液 *** 便宜配制方面，使用效果好。
在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加，换，切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。下面将介绍有关方面的内容：
二、免疫组化注意事项
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键之一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始。离体组织应尽快的进行取材固定，更好20分钟内，因为有些抗原若固定不及时可能就检测不到了。而对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受 *** 来选择相应的固定液，但在病理常规工作中很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中 *** 缓冲 *** 或4%缓冲多聚 *** 进行组织固定，利用其渗透 *** 强，对组织的作用均匀进行固定。组织固定时间更好在6-24小时内，一般组织固定时间不应超过24小时，随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。另外，非中 *** *** 缓冲液、含酸和含汞固定液亦可导致标记失败或减弱。
正确选择用于免疫组化的蜡块也是确保染色质量的关键因素之一。很多病例的组织蜡块不止一个，不同的蜡块中，组织成分常常并不完全一样，一般选择更具 *** 肿瘤特异 *** 的蜡块，更好含有内对照。更值得注意的是，所选取的蜡块除了要包含 *** 肿瘤特异 *** 的组织外，应尽量避免含有出血、坏死和脂肪组织。这些组织内的抗原大多已被 *** 或丢失，最终通常呈片状弥漫染色，除影响制片的美观外，容易导致误判或误诊。而且这些组织通常影响切片的质量。另外，更好不要选择冰冻剩余组织或脱钙组织，冰冻或脱钙一般也会影响组织内的抗原。
抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活 *** 剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变 *** 的抗原进行暴露和修复，使抗原 *** 得到一定程度的恢复过程。修复的 *** 有酶（胰酶、蛋白酶等）消化、加热法（水浴、微波和高压煮沸等）和超声处理等，或者综合利用以上 *** 。目前最常用的是加热煮沸法，少数用酶消化法。大量实验表明，固定时间越长的标本，所形成的交联就越紧密，抗原就越难以被激活，所需的修复强度也就越强。各种修复 *** 染色强度的比较为：高压法>水浴法>微波法。在日常工作中，要根据不同抗原的特 *** 选择合适的修复 *** 。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液（pH 6.0）、EDTA缓冲液（pH 8.0～9.0）等。修复液的PH值对染色结果也会产生相当大的影响。研究发现在高PH值约pH8.0～9.0时，都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值的修复液，尤其是对核阳 *** 的抗体。
免疫组化染色过程比较复杂、影响因素也很多，故应设置阳 *** 对照和阴 *** 对照。尤其是阳 *** 对照尤为重要。阳 *** 对照包括两种，一种为内对照，这是一种比较理想的对照，对照和测试组织都在同一张切片中，都处于相同的实验条件下，结果更可靠也更具有可比 *** 。另一种称为外对照，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶 *** 黑色素瘤，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳 *** 反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴 *** 结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳 *** 对照。另外，比较简单的 *** ，是采用阑尾作为阳 *** 对照。阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。因此，一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
三、一抗孵育多久
一抗孵育根据温度的不同，所需时间不同，37°C时需1-2小时，室温时需3小时，4°C时需18-24小时。
一抗指的是能够和非抗体 *** 抗原（特异 *** 抗原）特异 *** 结合的蛋白，也就是平常所说的抗体。二抗指的是能和抗体结合的抗体，主要用于检测抗体的存在，放大一抗的信号。
一抗的孵育时间与温度，抗体浓度有关。一般情况下，在37°C的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4°C的条件下，孵育18-24小时左右。
如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异 *** 吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特 *** 显色。
1、即用型之一抗体可按照厂家提供的实验 *** 作条件进行预先实验，摸索出更佳时间。
2、浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度进行成倍稀释预实验，以选择更佳稀释度。抗体的更佳稀释度是指：在无背景染色的情况下，获得更佳强度阳 *** 信号的抗体稀释度。一般染色背景深大多是抗体浓度过浓所致。
3、抗体孵育时的温度一般以25°C±8°C为准，在此区间内，一抗的孵育时间为30～60分钟。若温度较低应适当延长孵育时间，反之要适当减少孵育时间，或者在4°C冰箱过夜，冰箱4°C下孵育常需要注意的是：抗体孵育应在潮湿密封的环境中进行，避免抗体水分蒸发造成抗体的浓缩或干燥，致使染色背景产生。高质量的孵育盒是免疫组化的必要实验用品。
关于免疫组化一抗孵育时间的内容到此结束，希望对大家有所帮助。
